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糖原合成激酶-3β在内质网应激调控胃癌细胞侵袭中的作用

发布时间:2016-8-4      来源:admin      阅读次数:515

杜康1,马敏1,付政祺1,2

(1.江汉大学 医学院,湖北 武汉 430056; 2. 江大病理诊断所, 湖北 武汉 430056)

摘  要:目的:探讨糖原合成激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)在内质网应激调控胃癌细胞侵袭中的作用。 方法:以浓度为3 μmo l/L的衣霉素(Tunicamycin, TM)单独及联合运用浓度为10 mm o l /L的氯化锂(Lithium chloride, LiCl)处理胃癌SGC7901细胞24 h,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力, 并应用Western blot检测GSK-3β蛋白Ser9位点的表达。 结果:Transwell侵袭实验显示,联合运用TM+LiCl处理胃癌SGC7901细胞24 h,可明显改善TM所诱导的内质网应激对细胞侵袭性力的影响;Western blot结果显示,相对于对照组,TM处理组Ser9-GSK-3β蛋白的表达明显降低,联合运用TM+LiCl,可明显升高Ser9-GSK-3β蛋白的表达,差异有统计学意义(P <0.01)。结论:抑制GSK-3β的表达,可通过降低内质网应激明显增强胃癌细胞的侵袭力.

关键词:GSK-3β; 内质网应激; 胃癌;侵袭

 

Role of glycogen synthase kinase-3β in gastric cancer cell invasion regulated by endoplasmic reticulum stress

DU Kang1,MA Min1,FU Zhengqi 1,2

(1. Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei, China; 2. Jiangda Pathology Institute, Wuhan 430056, Hubei, China)

Abstract: AIM: To investigate the involvement of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) in gastric cancer cell invasion regulated by endoplasmic reticulum stress. METHODS: TM (3 μmol/L) alone or in combination with LiCl (10 mmol/L) was incubated with SGC7901 cells for 24 h, with the same concentrations of DMSO used as vehicle controls. After treatment, the invasion of gastric cancer cells was evaluated by Transwell chamber assays. The expression of phosphorylated glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) at Ser9 were examined by Western blot analysis. RESULTS: TM induced-endoplasmic reticulum stress decreased the invasion ability of gastric cancer SGC7901 cells and the phosphorylation of GSK-3β at Ser9. However, simultaneous treatment with Lithium chloride (LiCl) increased the invasion of gastric cancer cells by counteracting the activating effect of TM on GSK-3β, causing an increase in the phosphorylation of Ser9-GSK-3β. CONCLUSION: Inhibition of GSK-3β may increase the invasion of gastric cancer cells induced by endoplasmic reticulum stress.

Keywords: GSK-3β; Endoplasmic reticulum stress; Gastric cancer; Tumor invasion

 

引言

    糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)是胰岛素、Wnt、Notch等信号转导通路的重要分子,参与细胞分化、增殖、凋亡及基因表达等多种调控。越来越多的研究证据显示,GSK-3β在肿瘤的发生、侵袭与转移中发挥重要作用[1]。人体胃癌组织中,GSK-3β的表达与淋巴结浸润、转移和生存率呈负相关[2]。抑制GSK-3β表达可促进胃癌细胞SGC7901的迁移能力[3]。但GSK-3β调控肿瘤细胞侵袭、转移的机制尚不完全清楚。

    胃癌是我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一, 发病率和死亡率高。而导致其预后不良的最根本原因是肿瘤细胞的侵袭与转移[4]。因此,探究胃癌细胞侵袭与转移的机制,寻找靶向治疗途径,对降低胃癌患者的死亡率具有重要意义。本课题前期研究发现,内质网应激可降低胃癌细胞的侵袭力[5],且其通过激活GSK-3β而实现。本研究给予内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin, TM)和GSK-3b的特异性抑制剂氯化锂(Lithium chloride, LiCl)联合处理胃癌细胞SGC7901,通过检测GSK-3β蛋白Ser9位点磷酸化的表达变化及其与胃癌细胞侵袭力改变的关系,明确GSK-3β在内质网应激调控胃癌细胞侵袭中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞系SGC7901由华中科技大学同济医学院免疫学系惠赠,为本实验室保存。 Tunicamycin (TM)购自Alexis,溶于DMSO以3 mM 浓度-20 ℃保存。氯化锂 (LiCl)购自Sigma,溶于d2H2O以10M浓度-20 ℃保存。Ser9-GSK-3β 抗体购自Cell Signaling,β-actin (C4) 抗体购自Santa Cruz,Transwell侵袭试剂盒购自Millipore,Bicinchoninic acid (BCA)蛋白测定试剂盒购自Pierce。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理  SGC7901细胞接种在含10%小牛血清的RMPI-164培养基中,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养,每2-3d换1次液。细胞增长至约70-80%左右融合时胰酶消化传代。TM处理细胞的浓度为3μΜ LiCl处理细胞的浓度为10 mM,时间为24 h。

1.2.2 Western blot技术检测[6] SGC7901细胞收集后,BCA法测蛋白,进行SDS-PAGE电泳,电泳后湿转至PVDF膜,含5%脱脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS) 37 ℃封闭60 min,加1:1000稀释的抗Ser9-GSK3β 和β-actin抗体4℃孵育过夜。TBS-T漂洗5 min×3次,加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG 37 ℃孵育45 min。TBS-T漂洗5 min×3次,ECL化学发光试剂检测。

1.2.3 Transwell侵袭实验 向侵袭小室 (Transwell chamber)中加入制备好的密度为 (0.5-1.0)×109/L的无血清SGC7901细胞悬液,将小室置于含10%胎牛血清培养基的24孔板内培养24 h。用棉签轻轻刮除小室内未侵袭的细胞后,将小室底部置于试剂盒中的染色液里染色20 min,漂洗数次、风干。在显微镜下观察,细胞计数。

1.2.4统计学处理 全部数据经SPSS 13.0统计学软件处理,数据均采用均数±标准差()表示,相关因素分析采用Spearman等级相关分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 LiCl可明显抑制TM对GSK-3b表达的激活

TM及联合运用TM+LiCl处理胃癌细胞SGC7901,24小时后,Western blot实验结果显示: 3μΜ TM可明显下调胃癌细胞SGC7901中GSK-3b Ser9位点的磷酸化水平,应用GSK-3β的抑制剂LiCl [7]与TM联合处理胃癌细胞,发现 LiCl可明显升高由TM所诱导的Ser9-GSK-3b位点的表达下降 (图1)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1 Western blot方法检测Ser9-GSK-3b蛋白的表达

A: Western blot图;B:统计图

**P<0.01 vs 对照组, ##P<0.01 vs TM组

2.2抑制GSK-3β可明显降低内质网应激对SGC7901细胞侵袭性的抑制作用

TM及联合运用TM+LiCl处理胃癌细胞SGC7901,24小时后,Transwell侵袭实验结果显示:与对照组相比,TM处理组的SGC7901细胞的侵袭性明显减弱,联合运用LiCl(GSK-3β的抑制剂),SGC7901细胞的侵袭性明显增强,高于TM组(图 2)。

 

 

 

 

 

 

 

 

图2 Transwell实验检测胃癌细胞SGC7901侵袭能力的改变

**P<0.01 vs 对照组,##P<0.01 vs TM组

3 讨论

    内质网是真核细胞内蛋白质合成、折叠等的重要场所。缺氧、应激等因素的刺激,可引起细胞内未折叠/错误折叠蛋白累积,导致内质网应激[8]。近年研究发现,内质网应激可能在肿瘤细胞的生长、侵袭、转移中均发挥重要作用。人体胃癌组织中,内质网陪伴分子GRP78和GRP94高表达,且与肿瘤大小、侵袭深度和淋巴结转移等相关[6,9]。Honokiol诱导的内质网应激可调控calreticulin表达,抑制胃癌细胞的上皮间质转化及转移[10]。Piperlongumine可通过内质网-MAPKs-CHOP途径抑制肝癌细胞侵袭[11]。本课题组前期研究发现,TM诱导的内质网应激可降低胃癌细胞的侵袭力[5]

糖原合成酶激酶-3b (GSK-3b)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,除了调节糖代谢,还参与细胞的分化、增殖、凋亡调控。研究发现,GSK-3b的异常表达在肿瘤发生发展、侵袭、转移中发挥重要作用。人体胃癌组织中GSK-3b的阳性率为46% (129/281),且在早期胃癌组织中阳性率较高, 与淋巴结浸润、转移和生存率负相关[3]。GSK-3b可通过CXCR4/MMP-2途径,促进PANC1细胞侵袭[12]。抑制GSK-3b表达,可促进胃癌细胞SGC7901的迁移能力[13]。本课题前期研究发现,TM诱导的内质网应激,通过降低GSK-3b的Ser9位点(抑制性)磷酸化,激活GSK-3β,降低胃癌细胞的侵袭力[5]。为进一步明确,GSK-3b在胃癌细胞侵袭中的作用,本研究给予联合应用GSK-3b的特异性抑制剂LiCl发现,LiCl可通过增加GSK-3β 丝氨酸抑制性位点(Ser-9)的磷酸化,抑制其活性,明显改善TM所诱导的内质网应激对胃癌细胞侵袭的抑制作用。但GSK-3β 影响内质网应激调控胃癌细胞侵袭的机制有待进一步研究.

综上所述,本研究发现,GSK-3β在内质网应激调控胃癌细胞侵袭力中发挥作用:TM诱导的内质网应激,可通过降低GSK-3b的Ser9位点磷酸化,激活GSK-3β,降低胃癌细胞的侵袭力。抑制GSK-3β,可明显降低TM所诱导的内质网应激对胃癌细胞侵袭的抑制作用。

参考文献

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[3] Ryu YK, Lee YS, Lee GH, Song KS, Kim YS, Moon EY. Regulation of glycogen synthase kinase-3 by thymosin beta-4 is associated with gastric cancer cell migration. Int J Cancer, 2012, 131: 2067-77.

[4] Park JH, Ryu MH, Kim HJ, Ryoo BY, Yoo C, Park I, Park YS, Oh ST, Yook JH, Kim BS, Kang YK. Risk factors for selection of patients at high risk of recurrence or death after complete surgical resection in stage I gastric cancer. Gastric Cancer, 2015 Jan 23. [Epub ahead of print]

[5] 付政祺, 邹丰, 王绪明, 李艳, 刘丽江. 衣霉素诱导的内质网应激对胃癌细胞侵袭力的影响及机制,世界华人消化杂志,2014年,第22卷,第8期:1101-5.

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[13] Liu J, Zhang Y, Xu R, Du J, Hu Z, Yang L, Chen Y, Zhu Y, Gu L. PI3K/Akt-dependent phosphorylation of GSK3β and activation of RhoA regulate Wnt5a-induced gastric cancer cell migration. Cell Signal, 2013, 25: 447-56.

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